微生物学诊断（共7篇）
微生物学诊断 篇1
沙门菌( Salmonella) 属肠杆菌科,在自然界分布广,对人和畜禽均有致病性,同时该病的发生也易继发其他疾病,导致病情加重甚至死亡[1]。
沙门菌属均有致病性,具有极其广泛的动物宿主,最常侵害幼、青年动物,使之发生败血症、胃肠炎及其他组织局部炎症,易对成年动物引起散发性或局限性沙门菌病[2]。
仙台沙门菌( Sendai salmonella) 是感染人的一种常见沙门菌,可对人和动物引起原发性或继发性感染。当卫生不良、过度拥挤、气候恶劣、内服皮质类激素、分娩、长途运输以及发生其他病毒或寄生虫感染时,可引起鸽子发病,临床常用抗生素进行治疗。
1 材料
普通琼脂平板、药敏试验琼脂平板 ( M - H平板) 、麦康凯琼脂平板、绵羊脱纤鲜血琼脂平板、沙门菌 - 志贺氏菌分利用平板( SS平板) 、普通肉汤、三糖铁琼脂培养基斜面、西蒙氏柠檬酸钠琼脂斜面、糖发酵管、莱佛逊( Leifson) 氏鞭毛染色液等按照参考文献[3]介绍的方法,由西北农林科技大学动物医学院微生物实验室自制; 多价O血清、药敏纸片,由某微生物试剂有限公司生产; 小白鼠,由西北农林科技大学动物医学院实验动物中心提供; 鼠伤寒沙门菌标准菌,由西北农林科技大学动物医学院微生物实验室提供。
2 方法
2. 1 细菌的分离培养
无菌采取病死赛鸽的肝脏、脾脏,革兰染色镜检,采集的病料无菌操作连续划线接种普通琼脂平板、麦康凯琼脂平板、绵羊脱纤鲜血琼脂平板,从中分离得到1株可疑细菌,经过革兰染色镜检确定其纯度后接种到普通琼脂斜面,37℃培养24 h,4℃保存菌株,待用[4]。
2. 2 生物学特性试验和生化试验
生化试验和生物学特性的测定按照参考文献[2 - 3]的方法进行。将普通琼脂斜面上的纯细菌分别接种到普通琼脂平板、麦康凯琼脂平板、绵羊脱纤鲜血琼脂平板、普通肉汤及各种生化试验管,对生长的菌落进行革兰染色镜检。16 h肉汤培养物悬滴法观察运动性,莱佛逊( Leifson) 氏鞭毛染色法观察菌体及鞭毛。
2. 3 抗生素敏感性试验
对37℃、24 h肉汤培养物计数,调整菌量约为2. 4×109cfu / mL ; 革兰染色镜检纯度,再用灭菌棉签将普通肉汤培养物均匀涂抹于M - H平板,将药敏纸片压贴于M - H平板上,4℃放置2 h,然后经37℃、24 h培养,再判定分离得到的细菌对不同药物的敏感程度[5]。
2. 4 动物致病性试验
对37℃、24 h肉汤培养物计数; 革兰染色镜检纯度,试验组小白鼠分别腹腔注射初分离纯菌培养物( 约1. 5×108cfu / mL ) 0. 4 mL / 只、0. 2 mL / 只,灌胃0. 5 mL / 只; 对照组小 白鼠注射 肉汤剂量 为0. 4 mL / 只。无菌操作取小白鼠肝脏,并用其新鲜切面涂布麦康凯平板、普通平板,37℃培养24 h,观察菌落形态。制备传代菌37℃、24 h肉汤培养物,含菌量约为1. 5×108cfu / mL ,采用相同方法进行动物致病性试验。
2. 5 生长温度试验
纯菌接种肉汤,37℃培养24 h,含菌量约为6×108cfu / mL ,经高温处理后划线接种普通平板,37℃培养24 h,观察结果。采用上述方法进行低温生长温度试验。
3 结果与分析
3. 1 分离菌的生物学特性
分离菌为革兰阴性( G-) 的细小杆菌,散在排列,有鞭毛,能运动,无芽孢及荚膜。普通琼脂平板上菌落中等大小,无色,半透明,表面光滑湿润,边缘整齐,圆形隆起; 麦康凯琼脂平板上菌落中等大小,无色,半透明,表面光滑湿润,边缘整齐,圆形隆起; 绵羊脱纤鲜血琼脂平板上不溶血,形态特征与普通琼脂平板一致; SS平板上为小菌落,其余形态特征与普通琼脂平板一致; 在普通肉汤中呈均匀混浊性生长。
3. 2 生化试验结果
分离菌株在三糖铁琼脂培养基底层变黄斜面变红,底层产酸,沿穿刺线生长。在葡萄糖生化试验管中呈漏斗状生长,采用莱佛逊( Leifson) 氏鞭毛染色法染色,菌体呈蓝色,鞭毛呈红色,见表1。
注: ⊕表示产酸,产气; + 表示阳性; ( + ) 表示迟缓发酵; - 表示阴性。
3. 3 抗生素敏感性试验( 结果见表 2)
mm
注: 分离菌对抗生素有高度敏感( 抑菌圈直径≥16 mm) ,中度敏感( 16 mm > 抑菌圈直径≥3 mm) 和不敏感( 没有抑菌圈或抑菌圈直径 < 3 mm) 。
3. 4 动物致病性试验结果
腹腔注射初分离纯菌培养物的小白鼠,5 h后活动减少,精神沉郁,呼吸急促,皮毛倒立,7 h后死亡。试验组小白鼠经解剖后从肝脏分离、鉴定得到感染菌; 纯菌培养 物试验组 小白鼠,每天每只 灌胃0. 5 mL ,连续灌胃3 d后死亡。从灌胃组小白鼠胃、盲肠及粪便分别分离得到3株待检菌株,经生化试验鉴定为感染菌; 对照组小白鼠在试验观察期间未见明显异常。腹腔注射传代菌37℃、24 h肉汤培养物的小白鼠,12 h后活动减少,精神沉郁,48 h后精神恢复正常,试验组与对照组小白鼠经解剖后从肝脏均分离、鉴定得到感染菌,对照组小白鼠未见异常。
3. 5 生长温度试验结果
分离菌株生长温度最高为57℃,最低为5℃。
4 讨论
经微生物学诊断,以鼠伤寒沙门菌标准菌为参照,鉴定该菌为仙台沙门菌[6,7],虽然分离菌株为葡萄糖胺阳性,但杨正时[6]指出仙台沙门菌此指标存在0% ~ 9% 阳性波动范围。在试验过程中,以沙门菌多价O血清进行平板凝集。试验未鉴定出分离菌株血清型,可能为多价O血清含有的O因子血清种类较少,分离菌的血清型不在该范围,也可能是分离菌株含有Vi抗原,因有Vi抗原的菌株不被相应的抗O血清凝集。在细菌分离、鉴定时未分离得到其他病原菌,是否存在病毒感染还有待于进一步研究。
沙门菌的诊断方法主要有微生物学诊断法、PCR法、病理学诊断法、临床诊断等。微生物学诊断法特异性高,缺陷为操作繁琐、耗时长,在一定程度上限制了临床快速检测。PCR法、病理学诊断法、临床诊断等方法特异性不高、影响因素较多,与微生物诊断法相比有一定的局限性。因此,对沙门菌病的诊断还应以微生物学诊断法为主。
传代菌鞭毛丢失,致病性减弱。推测仙台沙门菌可能存在Vi抗原,这与3. 1中的假设存在一致性。Vi抗原存在于伤寒沙门菌及某些丙型副伤寒沙门菌的表面,其作用在于保护O抗原,使其免受相应O抗体的中和及补体的作用,是伤寒沙门菌的重要侵袭力。在普通培养基上多次传代后易丢失此抗原,可能是造成分离菌株致病性减弱的重要原因[2]; 另外多次传代可能造成分离菌株含有毒力基因的质粒丢失,不能正常编码相应产物,侵袭力降低,导致其致病性减弱。
仙台沙门菌的致病性类型与伤寒及甲、乙、丙三型副伤寒等血清型相同,属高度适应性,对于动物不能引起自然感染,高度适应于人类[2]。但是在饲养条件较差、气候突变、营养缺乏及其他传染病暴发时,可引起赛鸽机体抵抗力下降,环境中的病原菌包括人类自身携带的病原菌均可以水平传播的方式,通过饲料、饮水等感染赛鸽消化道。关于仙台沙门菌对动物特别是对赛鸽感染的病例鲜有报道,试验为仙台沙门菌对禽类致病性的研究奠定了基础。
分离菌株温度耐受性较强,可同时耐受57℃的高温和5℃的低温,表明此菌株环境适应性较好,这可能是引起本病大面积在鸽棚内暴发的重要因素。建议鸽棚内应以控制传染源,切断传播途径,保护易感鸽群为原则,淘汰病鸽,隔离疑似感染赛鸽,对发病初期的赛鸽可选用敏感抗生素进行治疗,再结合临床症状对症治疗,也可使用中药进行支持治疗; 做好卫生消毒工作,改善饲养条件; 对易感鸽群做好预防接种工作。有条件的饲养厂可采用分离菌做成灭活疫苗进行免疫防治,进而达到控制本病的目的。J. D.Robbins等[8]研究表明,Vi抗原是保护性抗原,结合3. 1和3. 3,若分离菌株存在Vi抗原的假设成立,可进一步研制仙台Vi多糖疫苗。
5 结论
从病死鸽肝脏、脾脏均分离得到致病性仙台沙门菌( Sendai salmonella) ,并指出该病的首选诊断方法为微生物学诊断法。
参考文献
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微生物学诊断 篇2
1）微生物：微生物是肉眼看不见的，必须在电子显微镜或光学显微镜下才能看见的所有微小生物的总称。
2）微生物的特点：1个体极小2分布广种类繁多3繁殖快4易变异 3）原核微生物与真核微生物区别：真核微生物有发育完好的细胞核，原核微生物只有拟核。第一章
4）病毒：病毒是没有细胞结构，专性寄生在活的敏感宿主体内的超微小生物。
5）病毒的特点：只能在电子显微镜下看见。没有核糖体，没有酶系统，不具备代谢能力，必须专性寄生在活的敏感宿主细胞内。
6）病毒的分类：按专性宿主分类：动物病毒，植物病毒，细菌病毒，放线菌病毒，藻类病毒，真菌病毒。按核算分类：DNA病毒，RNA病毒。7）类病毒：类病毒是比病毒更加小的致病感染因子。
8）朊病毒：朊病毒是一种引起牛，羊疾病的感染因子（蛋白质感染颗粒）。9）病毒的繁殖过程：1吸附2侵入3复制与聚集4宿主细胞裂解和成熟噬菌体粒子的释放。10）噬菌体的溶原性：毒性噬菌体，侵入宿主细胞后，随即引起宿主细胞裂解的噬菌体。温和噬菌体，侵入宿主细胞后，其核算附着并整合在宿主染色体上，和宿主的核酸同步复制，宿主细胞不裂解而继续生长，不引起宿主细胞裂解。含有温和噬菌体宿主细胞被称作溶原细胞。溶原细胞内的温和噬菌体核酸，称为原噬菌体。
11）噬菌体：噬菌体是感染细菌，真菌，放线菌或螺旋体微生物的病毒。第二章
12）细菌的形态：球状，杆状，螺旋状和丝状。分别称为球菌，杆菌，螺旋菌和丝状菌。13）细菌：一大类细胞核无核膜包裹，只存在称作拟核区的裸露DNA的原始单细胞生物。14）细菌的结构：细菌为单细胞结构，所有的细菌均有如下结构：细胞壁，细胞质膜，细胞质及其内含物，拟核。部分细菌有特殊结构：芽孢，鞭毛，荚膜，黏液层，衣鞘及光合作用片等。
15）细胞壁：细胞壁是包围在细菌体表最外层的，坚韧而有弹性的薄膜。16）原生质体：原生质体包括细胞质膜，细胞质及其内含物，拟核。
17）细胞质膜：细胞质膜是紧贴在细胞壁的内侧而包围细胞质的一层柔软而富有弹性的膜。（半渗透膜），含有蛋白质，脂质和多糖。脂质是由磷脂，甘油，脂肪酸和含氮碱组成。18）细胞质膜的生理功能：1,维持渗透压的梯度和溶质的转移2，膜上含有合成细胞壁和形成横膈膜组分的膜，故在膜的外表面合成细胞壁3，膜内的中间体含有细胞色素，参与呼吸作用。4，细胞质膜上含有酶，进行物质代谢和能量代谢5，细胞质膜上有鞭毛基粒，鞭毛由此长出，为鞭毛提供附着点。19）核糖体;合成蛋白质
20）拟核：细胞的核因没有核膜和核仁，故称为原始核或拟核。21）鞭毛：有细胞质膜上的鞭毛基粒长出穿过细胞壁伸向体外的一条纤细的波浪状的丝状物叫鞭毛。
22）细菌的染色方法简单染色法和复合染色法 23）革兰氏染色法：步骤1在无菌的条件下，用接种环挑取少量细菌于干净的载玻片上涂布均匀，固定。2用草酸铵结晶紫染色1MIN，水洗去掉浮色。3用碘-碘化钾溶液媒染1MIN，倾去多余染液。4用中性脱色剂如乙醇或丙醇脱色，革兰氏阳性菌不被褪色而呈紫色，革兰氏阴性菌被褪色而呈无色。5，用番红溶液复染1MIN，革兰氏阳性菌仍呈紫色，革兰氏阴性菌则呈现红色。24）革兰氏染色的机制：1）革兰氏染色与细菌等电点有关系：革兰氏阳性菌的等电点比革兰氏阴性菌的等电点低，说明革兰氏阳性菌带的负电荷比革兰氏阴性菌多。革兰氏阳性菌的等电点低，与草酸铵结晶紫结合的牢固，对乙醇脱色抵抗力强，所以革兰氏阳性菌呈紫色。2，革兰氏染色与细胞壁有关：革兰氏阳性菌的脂质的含量很低，肽聚糖含量高，革兰氏阴性菌则相反，因此用乙醇脱色时革兰氏阴性菌的脂质被乙醇溶解，增加细菌细胞壁的孔径和通透性，乙醇很易进入细胞内将结晶紫和碘-碘化钾复合物提取出来，噬菌体呈现无色。3,*革兰氏阳性菌含特殊的RNA-Mg2+盐与革兰氏染色有关。25）放线菌：放线菌因在固体培养基上呈辐射状生长而得名。分为三类营养菌丝，气生菌丝，孢子丝。
26）放线菌的结构：放线菌的菌体由纤细的，长短不一的菌丝组成，菌丝分枝，为单细胞，在菌丝生长过程中，核物质不断复制分裂，然后细胞不形成横膈膜，也不分裂，而是无数分枝的菌丝组成很细密的菌丝体。第三章
27）原生动物：原生动物是动物中最原始，最低等，结构最简单的单细胞动物。28）原生动物的营养类型：1全动性营养2植物性营养3腐生性营养
29）原生动物的繁殖：有性生殖和无性生殖（二分裂发，多分裂法，纵分裂或横分裂）30）原生动物的作用：所有原生动物在污水生物处理过程中都起着指示生物的作用。31）主要的原生动物：P71 32）微型后生动物：原生动物以外的多细胞动物叫后生动物。因有些后生动物体型微小，要借助光学显微镜方可看得清楚，故叫微型后生动物。33）藻类的繁殖;有性生殖和无性生殖。P84 34）真菌：真菌属低等生物，种类繁多，形态，大小各异，包括酵母菌，霉菌及各种伞菌。真菌属真核微生物，有单细胞和多细胞之分。
35）酵母菌：酵母菌是单细胞真菌。分发酵型和氧化型两种。氧化型的酵母菌则是无发酵能力或发酵能力弱而氧化能力强的酵母菌。球拟酵母菌，白色假丝酵母菌，类酵母的阿氏囊霉属，短梗霉属在石油加工业中起积极作用，如石油脱蜡，降低石油的凝固点等。处理废水及用酵母菌检测重金属。
36）酵母菌的繁殖：有性生殖和无性生殖（芽生殖和裂殖)37）霉菌：分为腐生和寄生
38）霉菌的繁殖：有性孢子和无性孢子繁殖，也可借助菌丝的片段繁殖。39）伞菌：无毒的有机废水可用于培养食用菌的菌丝体。40）酶：酶是由细胞产生的，能在体内或体外起催化作用的一类具有活性中心和特殊构想的生物大分子。
41）酶的分类：化学组分；单成分酶（只含有蛋白质）和全酶（蛋白质及辅基或辅酶的热稳定的非蛋白质小分子有机物或金属离子，全酶要在酶蛋白和辅酶同时存在起作用）
42）全酶的分类：1酶蛋白+非蛋白质小分子有机物2酶蛋白+非蛋白质小分子有机物+金属离子3酶蛋白+金属离子
43）酶的分类：六类，氧化还原酶，转移酶，水解酶类，裂解酶类，异构酶类和合成（连接）酶类。
44）酶的反应通式：氧化还原酶类：AH2+B=A+BH2
转移酶类：AR+B=A+BR
水解酶类：AB+H2O=AOH+BH
裂解酶类：AB=A+B
异构酶：---------葡萄糖=果糖（例）
合成酶：A+B+ATP=AB+ADP+Pi
或
A+B+ATP=AB+AMP+Pii 45）酶的特性：1酶具有一般催化剂的共性2酶的催化作用具有高度的专一性（只作用一种或以类物质）3酶的催化反应条件温和4酶对环境条件的变化极为敏感5酶的催化效率极高
46）酶促反应的动力学方程式：
E酶S底物ES中间产物P最终产物
47）酶的浓度对酶促反应速率的影响：下图
48)底物浓度对酶促反应速率的影响：P116 49)温度对酶促反应速率的影响：上图 50)PH对酶促反应速率的影响：P117 51)激活剂对酶促反应速率的影响：凡能激活酶的物质称酶的激活剂。分为无机离子激活剂和有机化合物两类。
52)抑制剂对酶促反应速率的影响：引起抑制作用的物质称为酶的抑制剂。抑制作用是指由于某些物质与酶的活性部位结合。分为不可逆的抑制作用和可逆的抑制作用。
53)培养基;根据各种微生物对营养的需要，包括水，碳源，能源，氮源，无机盐及生长因子等按一定的比例配置而成的，用以培养微生物的基质，称为培养基。
54)培养基配制的原则：1不同微生物，不同培养基2各种营养物的浓度及配比3调PH值4考虑加生长因子5培养基物美价廉
55)培养基的种类：按培养基组成物的性质分类：合成培养基，天然培养基（天然有机物配制而成的培养基），复合培养基。按物理性质分为;液体培养基，半固体培养基，固体培养基。根据培养基对微生物的功能和用途不同：选择培养基，鉴别培养基，加富培养基。56)营养物质进入微生物细胞的方式：单纯扩散，促进扩散，主动运输，基团转位
57)单纯扩散：单纯扩散是物理过程，不包括细胞的主动代谢。杂乱运动的，水溶性的溶质分子（水，无机盐，O2，CO2）通过细胞质膜中含水的小孔从高浓度区向低浓度区扩散，不与膜上的分子发生反应，这种扩散是非特异的，扩散速度慢。
58)促进扩散：细胞膜上的载体蛋白分子有和被运输物质特异结合的位置，这样载体在膜的外表面能够和物质结合，形成的底物-载体蛋白复合体，便从高浓度向低浓度区域扩散或越膜。由于被运输物质的浓度在膜的内表面较低，所以复合体倾向解离，被运输的物质就留在细胞内，而载体回到膜的外表面，只要存在需要运输物质的越膜浓度梯度，这个过程就将继续进行，从而加快了物质的运输速度。不消耗能量。
59)主动运输：当微生物细胞内积累的营养物质浓度高于细胞外的浓度时，营养物质就不能按浓度梯度扩散到细胞内，而是逆浓度梯度被“抽”进细胞内。这一过程需要渗透酶和消耗能量。渗透酶在此过程中起改变平衡点的作用，这种需要能量和渗透酶的逆浓度梯度积累营养物质的过程。60)基团转位：基团转位是存在于某些原核生物中的一种物质运输方式。与主动运输相比，有一个复杂的运输系统，被运输的物质发生了化学变化，主要用于糖的运输，运输总效果与主动运输相似，可以逆浓度梯度将营养物质移向细胞内，结果使细胞内结构发生变化的物质浓度大大超过未改变结构的同类物质的浓度。需要代谢能量。61)微生物的能量代谢：P135-P150
62）微生物的生长：微生物在适宜的环境条件下，不断吸收营养物质，按照自己的代谢方式进行新陈代谢活动。正常情况下，同化作用大于异化作用，微生物的细胞质量不断迅速增长，称为生长。
63）微生物的发育：从生长到繁殖这个由量变到质变的过程叫发育 64）代时：细菌两次细胞分裂之时的时间。65）生长曲线：
66)微生物的生存因子：微生物除了需要营养外，还需要环境中合适的生存因子，例如：温度，PH，氧化还原电位，溶解氧，太阳辐射，活度与渗透压，表面张力等。
67)根据微生物对温度的最适生长需求，可将微生物分为4大类：嗜冷菌，嗜中温菌，嗜热菌及嗜超热菌。
68)大多数细菌，藻类和原生动物的最适PH为6.5-7.5，他们对PH的适应范围为4-10。69)任何两种浓度的溶液被半渗透膜隔开，均会产生渗透压。
70)微生物之间的关系：微生物之间的关系有种内的关系和种间的关系。相同种内的关系有竞争和互助。不同种间关系有6种，竞争关系，原始合作关系，共生关系，偏害关系，捕食关系，寄生关系。
71)竞争关系：竞争关系是指不同的微生物种群在同一环境中，对食物等营养，溶解氧，空间和其他共同要求的物质互相竞争，互相收到不利影响。
72)原始合作关系：原始合作关系是指两种可以单独生活的生物共存于同一环境中，相互提供营养及其他生活条件，双方互为有利，相互受益。当两者分开时各自可单独生存。
73)共生关系：共生关系是指两种不能单独生活的微生物共同生活于同一环境中，各自执行优势的生理功能，在营养上互为有利而所组成的共生体，这两者之间的关系就叫共生关系。74)偏害关系：共存于同一环境的两种微生物，甲方对乙方有害，乙方对甲方无任何影响。一种微生物在代谢过程中产生一些代谢产物，其中有的产物对一种（或一类）微生物生长不利，或者抑制或者杀死对方。上述这种微生物与微生物之间的对抗关系叫偏害关系。分非特异性偏害和特异性偏害。
75)捕食关系：有的微生物不是通过代谢产物对抗对方，而是吞食对方，这种关系称为捕食关系。
76)寄生关系：一种生物需要在另一种生物体内生活，从中社区营养才得以生长繁殖，这种关系成为寄生关系。77)微生物在土壤中的分布：土壤中微生物的类群、数量与分布，由于土壤质地发育母质、发育历史、肥力、季节、作物种植状况、土壤深度和层次等等不同而有很大差异。土壤微生物中细菌最多，作用强度和影响最大，放线菌和真菌类次之，藻类和原生动物等数 量较少，影响也小。土壤中微生物的水平分布取决于碳源。土壤中微生物的垂直分布与紫外辐射的照射，营养，水，温度等因素有关。78)遗传和变异是一切生物最本质的属性。
79)遗传有保守性，是微生物在它的系统发育过程中形成的系统。80)遗传可改变的一面是变异
81)遗传是相对的，变异是绝对的。82)遗传和变异的物质基础DNA：P203 83)基因突变：基因突变即微生物的DNA被某种因素引起碱基的缺失，置换或插入，改变了基因内部原有的碱基排列顺序，从而引起其后代表现型的改变。当后代突然变现和亲代显然不同的，能遗传的性状时，就称为突变。
84)自发突变：自发突变是指某种微生物的自然条件下，没有人工参与而发生的基因突变。原因有多因素低剂量的诱变效应，互变异构效应。
85)诱发突变：诱发突变是利用物理或化学的因素处理微生物群体，促使少数个体细胞的DNA分子结构发生变化，在基因内部碱基配对发生错差，引起微生物的遗传性状发生突变。分物理诱变，化学诱变，复合处理及其协同效应，定向培育和驯化。
86)基因重组：两个不同形状个体细胞的DNA融合，使基因重新组合，从而发生遗传变异，产生新品种，此过程称为基因重组。
87)杂交;杂交是通过双亲细胞的融合，使整套染色体的基因重组；或者是通过双亲细胞的沟通，使部分染色体基因重组。
88)转化：受体细胞直接吸收来自供体细胞的DNA片段，并把它整合到自己的基因组里，从而获得了供体细胞部分遗传性状的现象，成为转化。
89)转导;通过温和噬菌体的媒介作用，把供体细胞内特定的基因携带至受体细胞中，使后者获得前者部分遗传性状的现象，称为转导。
90)质粒：质粒在原核微生物中除有染色体外，还含有另一种较小的，携带少量遗传基因的环状DNA分子，称为质粒，也叫染色体外DNA。质粒在基因工程中常被用作基因转移的运载工具-载体。
91)基因工程：基因工程是指在基因水平上的遗传工程，又叫基因剪接或核酸体外重组。基因工程是用人工方法把所需要的某一供体生物的DNA提取出来，在离体的条件下用限制性内切酶将离体DNA切割成带有目的的基因的DNA片段，每一段平均长度有几千个核苷酸，用DNA连接酶把它和质粒的DNA分子在体外连接成重组DNA分子，然后将重组体导入某一受体细胞中，以便外来的遗传物质在其中进行复制，扩增和表达，再进行重组体克隆的筛选和鉴定；最后对外源基因表达产物进行分离提纯，从而获得新品种。92)基因工程操作分5步：1先从供体细胞中选择获取带有目的基因的DNA片段（基因分离）； 2将目的DNA的片段和质粒在体外重组；（体外重组）3将重组体转入受体细胞（载体传递）；4重组体克隆的筛选与鉴定（复制表达）；5外源基因表达产物的分离与提纯（筛选，繁殖）
93）天然淡水水体是人类生活和工业生产用水的水源，也是水生动物和植物生长繁殖的场所。
94）水体自净过程;1有机污染物排入水体后被水体稀释，有机和无机固体物沉降至河底。2水体中好氧细菌利用溶解氧把有机物分解为简单有机物和无机物，并用以组成自身有机体，水中溶解氧急速下降至零，此时鱼类绝迹，原生动物，轮虫，浮游甲壳动物死亡，厌氧细菌大量繁殖，对有机物进行厌氧分解。3水体中溶解氧在异样菌分解有机物时被消耗，大气中的氧刚溶于水就被迅速用掉，尽管水中藻类在白天进行光合作用放出氧气，但复氧速率小于耗氧速率，氧垂曲线下降。在最缺氧点，有机物的耗氧速率等于河流的复氧速率。再往下游的有机物减少，复氧速率大于耗氧速率，氧垂1曲线上升。如果河流不再被有机物污染，河水中溶解氧恢复到原来的水平，甚至达到饱和。4随着水体的自净，有机物缺乏和其他原因（例如阳光照射，温度，PH变化，毒物及生物的抗洁作用等）使细菌死亡。据测定，细菌死亡数大约为80%-90%.95）碳循环：
96）脂质的转化：P274 97）氮循环：P278 98）显微镜的分辨率：指显微镜能分辨出物体两点间的最小距离
分辨力=0.61xλ/N.A.计算题
采用目镜为16X，物镜为40/0.65的光学系统，直径为0.3μm的微生物在显微镜下是否可分辨 解：
分辨率=0.61xλ/N.A.由题目知：N.A.=0.65
λ=0.55
分辨率=0.61x（0.55/0.65）=0.516μm>0.3μm
微生物学诊断 篇3
1 材料
普通营养琼脂平板及斜面、普通肉汤、亮绿胆盐-四硫磺酸钠肉汤、M.H.琼脂平板、麦康凯琼脂平板、绵羊血琼脂平板、三糖铁琼脂斜面、柠檬酸盐琼脂斜面、葡萄糖、乳糖、M.H.培养基等生化试验培养基,按参考文献[5]制备;药敏试纸,购自杭州某微生物试剂有限公司;沙门氏菌多价血清,购自宁波某生物公司;小白鼠,由西北农林科技大学动物医学院实验动物中心提供。
2 方法
2.1 细菌的分离培养及生物学特性试验
无菌条件下采取发病弱小的死亡犊牛肝脏、脾脏、粪便接种于普通营养琼脂平板、麦康凯平板、绵羊血琼脂平板,肝块肉汤培养基做厌氧培养,粪便再接种亮绿胆盐-四硫磺酸钠肉汤,37℃培养24 h,划线接种麦康凯平板,37℃培养24 h。将分离到的可疑菌接种到普通营养琼脂斜面,37℃培养24 h,4℃培养保存待鉴定。
2.2 生化试验
生物学特性和生化试验按参考文献[2,5]介绍的方法进行。
2.3 抗生素敏感性试验
将分离菌的普通琼脂斜面纯培养物接种到普通肉汤,37℃培养12 h,镜检为纯G-小球杆菌。用麦氏比浊法计数,将细菌浓度调到3.5×108/m L,用无菌棉签将肉汤培养物均匀涂抹于M.H.琼脂平板上,每皿贴4种抗生素试纸片并压实,4℃作用2 h,再37℃培养24 h,观察结果。
2.4 动物致病性试验
取健康小白鼠8只,在试验前饲养3 d,无异常后将小白鼠随机分成2个组,试验组6只,对照组2只。试验组小鼠分2组,每组3只,分别腹腔注射浓度为4.5×108/m L的分离菌肉汤培养液0.2 m L、0.4 m L;对照组小鼠腹腔注射无菌肉汤培养液0.2 m L、0.4 m L。接种后隔离饲喂,饲喂条件相同,每2 h观察一次症状,对死亡小白鼠进行解剖,观察其病理变化,取死亡小白鼠病料进行细菌分离培养。
2.5 血清型鉴定
将分离菌在普通琼脂斜面反复传代8次,丢失菌毛及表面的微荚膜,用无菌生理盐水将斜面上的细菌冲洗后,甲醛灭活后放入离心管中,6 000 r/min离心20 min,弃去上清液,得到的菌体用生理盐水洗涤3次,配成菌液,用沙门氏菌多价诊断血清做玻片凝集试验,测定血清型。
3 结果
3.1 分离菌的生物学特性
革兰氏阴性(G-)小球杆菌,散在排列,初分离有微荚膜有鞭毛,无芽孢,在麦康凯平板上生长菌比普通平板生长菌杆状明显,在绵羊血琼脂平板上杆状明显。普通琼脂平板37℃培养24 h,长出中等大小、圆形、凸起、边缘整齐、表面光滑、湿润的菌落。绵羊血琼脂平板37℃培养24 h生长出灰色、中等大小、无溶血、圆形、边缘整齐、表面光滑、湿润的菌落。麦康凯平板37℃培养24 h,长出中等大小、无色、透亮、圆形、凸起、边缘整齐、表面光滑、湿润菌落。
3.2 生化试验结果
对分离菌进行生化试验,结果见表1。
注:+表示阳性,-表示阴性,⊕表示产酸产气。
3.3 抗生素敏感性试验结果
应用17种常用抗生素进行药敏试验,结果见表2。
mm
注:抑菌环直径<10 mm为耐药,在10~20 mm之间为中度敏感,>20 mm为高度敏感。
3.4 动物致病性试验结果
对照组小白鼠注射普通肉汤,3 d未表现任何临床症状,健康。注射0.2 m L肉汤培养物12~15 h时小白鼠活动减弱,皮毛倒立,呼吸加快,蜷缩一团,16 h后全部死亡。注射0.4 m L肉汤培养物12 h后小白鼠全部死亡。剖检死亡小鼠,肝脏出血坏死,颜色变暗,质地变软,个别肝脏白色钙化;脾脏肿大、坏死、出血。从死亡小白鼠的肝脏、脾脏分离鉴定到与感染菌相同的革兰阴性(G-)小球杆菌。
3.5 血清型鉴定
使用经过丢失菌毛和荚膜的细菌,用生理盐水洗涤3次,用一定浓度的菌悬液做血清型鉴定,与沙门氏菌12种标准多价血清不发生凝集,与单因子血清也未发生凝集。
4 分析与讨论
1)犊牛腹泻由多种病原微生物及寄生虫引起,临床上常见发病季节为初春和冬季,由于气候的影响,细菌性腹泻比较常见,常见有致病性大肠杆菌、沙门氏菌、变形杆菌、绿脓杆菌等致病菌,寄生虫及病毒引起的犊牛腹泻临床上也比较多,应引起高度重视[4,6,7]。本次从发病牛粪便、肝脏未分离到其他致病性细菌,粪便寄生虫检验也未检出引起牛腹泻的寄生虫,临床上选用敏感抗生毒治疗并服用益生菌,发病牛痊愈。可以确定本次发病牛是由沙门氏菌引起的腹泻。
2)经微生物特性生化试验试验鉴定及参考资料介绍[2,5]的细菌,分离菌为鼠伤寒沙门氏菌,血清型没有鉴定出来,是由于沙门氏菌血清型太多[1],用于鉴定的血清型只有12种,分离菌没有包含在此12种血清型内。
3)对沙门氏菌引起的疾病,临床上选用敏感抗生素进行治疗有一定效果,同时使用其他敏感药物及中草药进行辅助治疗,效果更加明显,对治疗痊愈的牛饲喂多种益生菌制品补充体内正常菌群,同时可以控制在治疗期间的牛不会发生其他细菌性疾病[6,7]。预防该病必须做到三个环节,控制好传染源,对环境进行科学的消毒处理,切断传播途径,健康牛口服沙门氏菌弱毒活疫苗及多种益生菌制品,建立肠道中的正常菌群,使致病菌不能生存。
参考文献
[1]陈溥言.家畜传染病学[M].5版.北京:中国农业出版社,2006.
[2]李健强,李六金.兽医微生物学实验实习指导[M].西安:陕西科学技术出版社,1999.
[3]陆承平.兽医微生物学[M].4版.北京:中国农业出版社,2007.
[4]东秀珠,蔡妙英.常见细菌系统鉴定手册[M].北京:科学出版社,2001.
[5]余贺.医学微生物学[M].北京:人民卫生出版社,1983.
[6]穆杨,柯霓霞,许信刚,等.犊牛腹泻病原的分离鉴定[J].黑龙江畜牧兽医,2007(5):79-80.
食品微生物学总结 篇4
科赫—细菌学的奠基人,主要贡献：建立了微生物研究基本技术，包括细菌的分离纯化技术，培养基的设计、细菌染色技术。发现了许多病原菌，提出了科赫法则。
安东·列文虎克（1632~1723）—微生物学的先驱者,自制显微镜观察到微生物。李斯特--提出手术中无菌操作的方法，建立了外科消毒术.弗来明—青霉素发现者,霉菌菌落周围出现抑制细菌现象
2、微生物的分类单元有哪些？基本分类单元是什么？
种以上可依次分成7级：界、门、纲、目、科、属、种，种是最基本的分类单位，每一分类单位之后可有亚门、亚纲、亚目、亚科.....概念：
肽聚糖：是由N－乙酰胞壁酸（NAM）和N－乙酰葡糖胺（NAG）以及短肽链（主要是四肽）组成的亚单位聚合而成的大分子聚合物。
伴孢晶体：少数芽孢杆菌在形成芽孢的同时，会在芽孢旁形成一个菱形、方形或不规则的碱溶性蛋白晶体称为伴胞晶体（即δ内毒素）。
芽孢：某些细菌在其生长发育后期，在细胞内形成的一个圆形或椭圆形、厚壁、含水量低、抗逆性强的休眠构造,称芽孢。
菌落：在固体培养基上（内）以母细胞为中心的一堆肉眼可见的有一定形态、构造的子细胞的群体。
病毒粒子：成熟的或结构完整、有感染性的病毒个体
温和噬菌体：在短时间内不能连续完成吸附、侵入、增值、成熟和裂解这五个阶段而实现繁殖的噬菌体
噬菌斑：噬菌体侵染细菌细胞,导致寄主细胞溶解死亡.因而在琼脂培养基表面形成的空斑
3、试述革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌肽聚糖单体构造差别。组成成分不同：
革兰氏阳性菌：肽聚糖（基本结构），包括聚糖骨架，四肽侧链，五肽交联桥 磷壁酸（特殊成份），包括膜磷壁酸，壁磷壁酸 表面蛋白（特殊成分），包括SPA,M蛋白
革兰氏阴性菌:肽聚糖（基本结构），包括聚糖骨架，四肽侧链 外膜（特殊成分），包括脂蛋白，脂质双层，脂多糖
4、细菌细胞的一般构造特殊构造各有哪些？（一般构造了解）
一般构造:所有细菌都有.包括：细胞壁、细胞膜、拟核、间体、细胞质、核糖体、颗粒状内含物
特殊构造:并非所有细菌都有，只存在于某些细菌、甚至是某特定的生理阶段 包括：鞭毛、菌毛、性菌毛、糖被和芽孢
5、霉菌的菌丝根据有无隔膜可分为几类？各举一例？霉菌的繁殖方式可分为哪几类？分别可产生哪些孢子？
无隔菌丝 有隔菌丝 1）菌丝片段
2）孢子：无性孢子（孢囊孢子 ；分生孢子；节孢子；厚垣孢子）；性孢子（卵孢子 ；接合孢子 ；子囊孢子；担孢子）
6、试比较毛霉、根霉、曲霉和青霉的异同。
7、病毒粒子包括哪些基本结构？并说明其化学组成 核衣壳（基本结构）：
1）核酸→基因组： DNA/RNA（双股/单股）
2）衣壳→衣壳粒（形态亚单位）→多肽（结构亚单位）营养：
8、什么叫生长因子？包括哪几类化合物？是否任何微生物都需要生长因子？如何满足微生物对生长因子的要求？
生长因子：通常指那些微生物生长所必需而且需要量很小,但微生物自身不能合成或合成量不足以满足机体需要的有机化合物。
包括维生素、生物碱、卟啉、甾醇、短链的分支或直链脂肪酸、氨基酸等
不是，需要在充足氮 碳源 水 无机盐的条见下，有些不能生长，按微生物对生长因子的需要与否，可分为三种类型：
（1）生长因子自养型微生物
它们不需要从外界吸收任何生长因子
（2）生长因子异养型微生物
它们需要从外界吸收多种生长因子才能维持正常生长
（3）生长因子过量合成的微生物
少数微生物在其代谢活动中，能合成并大量分泌某种维生素等生长因子
9、简述细胞膜运送营养物质的四种方式及其特点
1）单纯扩散(simple diffusion or passive diffusion):又称被动运送,指细胞膜在无载体蛋白参与下，单纯依靠物理扩散方式让营养物质被动通过的一种运输方式。2）促进扩散(facilitated diffusion/transport)：指溶质在运送过程中，必须借助细胞膜上的底物特异载体蛋白的协助，但不消耗能量的一类扩散性运送方式。3）主动运送(Active transport)：指一类需要提供能量并通过细胞膜上特异性载体蛋白构象的变化，而使膜外环境中低浓度的溶质运入膜内的一种运送方式。是微生物吸收营养物质的主要方式。
4）基团移位(Group translocation)：指溶质在运送过程中既需特异性载体蛋白的参与，又需消耗能量，而且溶质在运送前后还会发生分子结构变化的一种运送方式。
10、常见的培养四大类微生物的培养基是什么？
细菌：牛肉膏蛋白胨培养基 放线菌：高氏一号培养基
霉菌：察氏合成培养基或 PDA(Potato-Dextrose-Agar)酵母菌：麦芽汁培养基 代谢相关概念
有氧呼吸：底物按常规方式脱氢后，脱下的氢经呼吸链传递，最终被外源分子氧接受（分子氧作为最终氢受体）的氧化过程。
无氧呼吸：又称厌氧呼吸，指一类呼吸链末端的氢受体为外源无机氧化物（少数为有机氧化物）的生物氧化。这是一类在无氧条件下进行的、产能效率较低的特殊呼吸。
发酵：在生物氧化中发酵是指在无氧等外源氢受体的条件下，底物脱氢后所产生的还原力[H]不经过呼吸链传递而直接交给某一内源性中间代谢物接受，以实现底物水平磷酸化产能的一类生物氧化反应。生长：
11、什么是纯培养？纯培养如何获得？
纯培养：微生物学中把从一个细胞或一群相同的细胞经过培养繁殖而得到的后代,称纯培养（物）。
获得纯培养的方法 ：①液体稀释法 ②倾注平板法 ③平板涂布法 ④平板划线法 ⑤单细胞分离法 ⑥选择培养法
12、什么是生长曲线？试说明制作单细胞微生物生长曲线的方法。单细胞微生物的典型生长曲线可分几个时期？各有何特点？ 在生产上延长稳定期和缩短延滞期(lag phase)的措施有哪些？
定量描述液体培养基中微生物群体生长规律的实验曲线，称为生长曲线(Growth Curve)。制作：将少量的纯种单细胞微生物接种到恒容积的液体培养基中，在适宜的条件下培养，每隔一定时间取样，测定单位体积里的细胞数。以培养时间为横坐标，以单位体积里的细胞数的对数值为纵坐标，绘制的曲线，即生长曲线。生长曲线分为四个阶段：延滞期；对数期；稳定期；衰亡期。1）延滞期：指将少量微生物接种到新鲜培养液中后，在开始培养的一段时间内，因代谢系统适应新环境的需要，细胞数目不增加的一段时期。特点：①生长速率常数= 0 ②细胞体积增长,细胞内RNA、DNA含量增高。
④合成代谢活跃，核糖体、酶类和ATP合成加快，易产生各种诱导酶。⑤对外界不
2）对数期
指在生长曲线中，紧接着延滞期的一段细胞数按几何级数增长的时期。
特点：①生长速率常数R最大，细胞每分裂一次（即繁殖一代）所需要的时间 ——代时或原生质增加一倍所需的倍增时间最短。②细胞进行平衡生长，菌体内各种成分最为均匀 ③酶系活跃，代谢旺盛。3）稳定期（stationary phase）又称恒定期或最高生长期。
特点：①生长速率常数R=0，新增殖的细胞数与老细胞的死亡数几乎相等，细胞
数目达到最高水平。
②细胞分裂速度下降，开始积累内含物，产芽孢的细菌开始产芽孢。③开始积累代谢产物。4）衰亡期（decline phase）
特点：①微生物死亡数超过新增殖数，活菌数急剧下降，出现“负生长”。②细胞出现多形态，大小不等，有时出现畸型。有的微生物在此期会进一步合成或释放次生代谢物。芽孢菌的芽孢开始释放。
③因菌体本身产生的酶及代谢产物的作用，使菌体死亡、自溶等，发生自溶的菌生长曲线表现为向下跌落的趋势。良条件反应敏感，如氯化钠浓度、温度、抗生素等理化因素。
延长稳定期措施：①补充营养物质（补料）；②调pH ；③调整温度等。缩短延滞期措施：加大接种量、用对数期的作为菌种、用相应的培养基
13、根据微生物生长的最适温度不同，可以将微生物分为几种类型？
根据微生物生长 的温度范围，将微生物划分为三个类型： 1）低温型微生物（嗜冷微生物）2）中温型微生物（嗜温微生物）3）高温型微生物（嗜热微生物）
14、细菌和真菌常用的培养温度是多少？生长的适宜pH范围？ 光合细菌生长的最适条件是①温度15～20℃时，光照30000～50000lx，培养基pH值为7.0；②温度25～30℃时，光照为3000～5000lx，培养基的pH值为7.0 培养真菌最适pH为4.0～6.0最适温度为22～28℃,某些深部感染的真菌则在37℃中生长最好。培养真菌需要较高的温度与氧气。
光复活作用：把经紫外线照射后的微生物立即暴露于可见光下时，可明显降低其死亡率的现象，称为光复活作用。
15、简述菌种保藏原理并说明几种常用菌种保藏方法
菌种保藏原理：首先要挑选典型菌种或典型培养物的优良纯种（最好是分生孢子、芽胞等休眠体）；其次是要创造一个有利于它们长期休眠的良好环境条件，如干燥、低温、缺氧、避光、缺营养以及添加保护剂等。常用菌种保藏方法：冰箱保藏法（斜面）；冰箱保藏法（半固体）；石蜡油封藏法；甘油悬液保藏法；沙土保藏法；冷冻干燥法；液氮保藏法。生态：
共生：两种生物共居在一起，相互分工合作，相依为命，以至达到难分难解、合二为一的极其紧密的一种相互关系。
拮抗：又称抗生，指由某种生物所产生的特定代谢产物可抑制他种生物的生长发育甚至杀死它们的一种相互关系。食品微生物部分：
概念：大肠菌群：是指在一定培养条件下能发酵乳糖、产酸产气的需氧和兼性厌氧的革兰氏阴性无芽孢杆菌。该菌群主要包括埃希氏菌属、肠杆菌属、柠檬酸杆菌属等细菌。
食物中毒：指经口摄入了含有生物性、化学性有毒有害物质的食品或者把有毒有害物质当作食品摄入后出现的非传染性的急性、亚急性疾病，称为食物中毒 商业灭菌：也可以叫做商业无菌，指食品经过杀菌处理后，按照所规定的微生物检验方法，在所检食品中无活的微生物检出或仅能检出合理范围内的非病原菌，是一个标准。
举出酸奶、纳豆菌、啤酒、葡萄酒、白酒、酱油、腐乳、丹贝生产中常用的生产菌种及其作用。
酱油是以蛋白质原料和淀粉质原料为主，经米曲霉等多种微生物共同发酵酿制而成。
丹贝：少孢根霉丹贝又称天培（Tempeh），是印度尼西亚的传统大豆发酵制品。面包是以面粉为主要原料，以糖、油脂和鸡蛋等为辅料利用酵母菌发酵生产出来的一种发酵食品
啤酒是以优质大麦芽为主要原料，酒花、大米或玉米等为辅料，经过制麦、糖化、啤酒酵母发酵等工序酿制而成的一种含有CO2、低酒精浓度和多种营养成分的饮料酒
葡萄酒：有酿酒酵母、葡萄酒有孢汉逊酵母（Hanseniaspora vineae）、葡萄汁有孢汉逊酵母(H.uvarum)等。酿酒酵母是主要的菌种，在健壮的葡萄上含量约为50 CFU/g 白酒：大曲白酒:用小麦、大麦等原料发酵制成。大曲中微生物主要是曲霉和酵母菌及少量细菌。小曲白酒:用米粉和米糠加中药发酵制成。麸曲白酒:用麸皮酒糟制成散状曲经发酵而成 腐乳：霉菌型腐乳有腐乳毛霉、鲁氏毛霉、总状毛霉、华根霉(Rhizopus chinensis)等。细菌型腐乳菌种微球菌属（克东腐乳）和枯草芽孢杆菌（武汉腐乳）纳豆菌:属枯草芽孢杆菌纳豆菌亚种
普通酸奶：主要是嗜热链球菌和保加利亚乳杆菌。
嗜酸菌乳：主要用嗜酸乳杆菌或者嗜酸乳杆菌和其它乳酸菌的混合菌种。双歧杆菌乳：主要是双歧杆菌和嗜热链球菌或嗜酸乳杆菌等的混合菌种。
益生菌乳：多数是由多菌种共发酵，常含有双歧杆菌、嗜酸乳杆菌、嗜热链球菌、保加利亚乳杆菌或瑞士乳杆菌等
17、什么是水活度值？大多数细菌、酵母菌和霉菌生长的最低水活度？
水活度值是指食品在密闭容器内水的蒸汽压（P）与同温同压下的纯水蒸汽压（P0）之比值
微生物类群
最低Aw值范围
微生物类群
最低Aw值
大多数细菌
0.99~0.90
嗜盐性细菌
0.75
大多数酵母菌
0.94~0.88
耐高渗酵母
0.60 大多数霉菌
0.94~0.73
干性霉菌
0.65
19、一般从哪几个方面进行食品腐败变质的鉴定？
1、感官鉴定：主要检验食品的色泽、气味、口味、状态等。
2、化学鉴定：含氮量高的食品：常测定挥发性盐基总氮、三甲胺、组胺等。碳水化合物丰富的食品：常测定pH、有机酸含量等。
3、物理指标：测定食品浸出物的量、浸出液的电导度、折光率、冰点下降、黏度上升等指标。
4、微生物检验：常测定细菌总数、大肠菌群的近似数和霉菌等。一般食品中活菌数达到108cfu.g-1时，则可认为食品处于初期腐败阶段。20、食品的微生物污染途径有哪些？
1、内源性污染
食品原料本身带有微生物。
2、外源性污染
通过水、空气污染、人及动物、加工设备及包装材料和土壤污染。
21、食品卫生标准中的微生物指标有哪些？ 食品中微生物指标的常见检验项目如下：菌落总数、大肠菌群计数、大肠杆菌计数、肠道致病菌（沙门氏菌、志贺氏菌、金黄色葡萄球菌）、副溶血性弧菌、单核细胞增生李斯特氏菌、双岐杆菌、空肠弯曲菌、霉菌计数和酵母计数。
22、简述大肠菌群概念以及食品中大肠菌群最大可能数的检验意义。
大肠菌群（coliforms）是指在一定培养条件下能发酵乳糖、产酸产气的需氧和兼性厌氧的革兰氏阴性无芽孢杆菌。该菌群主要包括埃希氏菌属、肠杆菌属、柠檬酸杆菌属等细菌。大肠菌群被许多国家用作食品卫生质量评价的指标菌。检测大肠菌群的食品卫生意义：它可作为粪便污染食品的指标菌，大肠菌群数的高低，表明了食品被粪便污染的程度和对人体健康危害性的大小。它可以作为肠道致病菌污染食品的指标菌，大肠菌群与肠道致病菌有相同来源，在外界环境中生存时间也与主要肠道致病菌相近。
23、细菌性食物中毒的种类，致病性细菌举例。按发病机理可分为三型：
①感染型中毒。细菌在食品中大量繁殖，摄取了这种带有大量活菌的食品，肠道粘膜受感染而发病。沙门氏菌、副溶血性弧菌、变形杆菌、致病性大肠杆菌等皆可引起此型。
②毒素型中毒。由细菌在食品中繁殖时产生的毒素引起的中毒，摄入的食品中可以没有原来产毒的活菌。如肉毒中毒、葡萄球菌肠毒素中毒。
③过敏型。由于细菌的作用，食品中产生大量的有毒胺（如组胺）而使人产生过敏样症状的食物中毒，引起此型中毒的食品为不新鲜或腐败的鱼。含组胺较多的鱼为鲭科的鲐鱼，科的蓝圆和竹荚鱼，金枪鱼科的金枪鱼、扁舵鲣、鲔鱼和鲱科的沙丁鱼。这些鱼青皮红肉，即鱼皮为黑青色，而肉色较红，因其中血管系统较发达，含血红蛋白较多。引起此型中毒的细菌是含组胺酸脱羧酸酶的细菌，其中酶活性最强的为摩根氏变形杆菌、组胺无色杆菌和溶血性大肠杆菌。
细菌性食物中毒可按致病菌分类，分为沙门氏菌食物中毒、副溶血性弧菌食物中毒、肉毒梭状芽孢杆菌食物中毒等。
24、病原菌特性（金黄）。
金黄色葡萄球菌致病菌株可产生多种毒素和酶，致病性强。
微生物学诊断 篇5
布鲁氏菌病缺乏有效的治疗手段, 为了做好诊断、疫情监测、流行病学调查, 控制人畜布鲁氏菌病的流行, 优良的诊断技术是布鲁氏菌病防治的先决条件。下面就布鲁氏菌病的诊断技术做一概述。
1 布鲁氏菌检测技术发展
长期以来, 诊断技术的改进一直是布鲁氏菌病研究比较活跃的领域。细菌培养法可以直接检出布鲁氏菌, 得出确定性诊断结论, 但布鲁氏菌分离培养条件要求苛刻, 需要几天至几周时间, 不能满足快速检测的要求。
随着免疫学技术的不断成熟和发展, 在布鲁氏菌病中得到应用, 平板凝集反应 (PAT) 、试管凝集试验 (SAT) 等血清凝集反应和免疫电泳、补体结合试验、反向间接血凝、酶联免疫及放射免疫分析方法等诊断方法, 其中酶联免疫吸附试验 (ELISA) 和补体结合试验 (CFT) 是国际贸易指定试验, 而缓冲布氏杆菌抗原试验是国际贸易规定试验[1], 但是所有这些方法均不能严格区分疫苗免疫和强毒自然感染诱导的血清学反应, 易出现假阳性和假阴性, 使这些方法的应用受到限制。
2 分子生物学技术在布鲁氏菌病中诊断中的应用
随着分子生物学技术不断成熟和发展, 已广泛应用于感染性疾病的诊断和其他分子生物学研究领域, 开辟了布鲁氏菌病及布鲁氏菌污染物早期诊断和检测的新途径, 为防疫 (或防治) 部门提出有效防控措施和科学决策具有十分重要意义。
2.1 特异性PCR检测
Fekete等[1、2] (1990) 首次报道了用PCR方法检测布鲁氏菌的方法, 目的片段为635bp, 该序列是编码牛种布鲁氏菌S19的43KDa外膜蛋白基因的一部分, 该方法对布鲁氏菌属是特异的, 适于布鲁氏菌属所有种和生物型, 非常敏感 (低于100个细菌) , 由于专利的原因, 作者没有公布引物和靶序列的相关内容, 因此这个实验从未被其他实验室重复过。唐浏英[3]等 (1995) 针对牛布鲁氏杆菌36k Da OMP基因设计引物, 扩增180bp产物, 是6个种间的同源性很高的保守序列, 检测结果证明具有良好的特异性和敏感性。李兰玉[4]等 (2000) 针对牛布鲁氏杆菌31k Da OMP基因设计引物, 试验结果表明其特异性和敏感性也较好, 但当进行实际应用时不同地区和不同病期患者的阳性率波动较大, 而且不能区分感染和免疫, 也不能判明是发病者或是感染者, 只能表明是否受过感染。王胜昌[5] (2002) 等利用编码31k Da布鲁氏杆菌蛋白 (BCSP31) 的基因设计两对特异性的引物, 对布鲁氏杆菌R型、S型抗原, 及其他不同病原菌分别进行内、外引物PCR反应及套式PCR反应, 试验证明此PCR方法具有特异性强, 敏感性高的特点, 尚未进行实际应用评测。有学者认为PCR技术还不稳定, 尚不能作为确诊依据, 应结合其他检查判定结果。
2.2 核酸探针检测
核酸探针检测方面, 王希良[6]等 (1996) 构建了p BC4重组质粒, 经KpnⅠ和Bam HⅠ双酶切回收224bp的牛布鲁氏杆菌544A DNA片段, 建立了Dot-blot, 灵敏度可达到5pg, 用该方法检测我国19株布鲁氏菌均出现阳性杂交信号, 而对5种与布鲁氏菌有交叉反应的革兰氏阴性菌、人的白细胞c DNA等均无阳性杂交信号。Mater[7]等 (1996) 扩增的223bp的核酸保守序列, 用地高辛标记做探针用于病人血清的检测, 血清学检测为阳性和慢性病人的血清, 探针杂交也为阳性, 用该引物对对上述病人的血清进行PCR扩增, 全部扩增出223bp的核酸片段, 而对9例副伤寒患者的血清样本进行扩增, 结果均为阴性。Fernanderz-L[8]等 (2000) 以牛种布鲁氏菌16S r RNA做探针, 对所有布鲁氏菌种及变种以及9株临床分离株进行杂交检测, 结果该方法可将猪种布鲁氏菌2、3、4、5生物型与几乎全部的布鲁氏菌区分开, 与布鲁氏菌存在交叉反应的17株革兰氏阴性菌均未出现阳性杂交信号, 证明16Sr RNA全菌杂交技术在布鲁氏菌检测鉴定中是非常有价值的。
2.3 环介导等温扩增技术 (LAMP)
LAMP与PCR相比, 以其简便、灵敏、快速、特异的优势被大量研究, 并在多种病原微生物的感染诊断中得到了成功应用。新型可视化LAMP的出现使该方法的应用更加简便、安全, 直接可以通过肉眼观察判定结果, 很多实验室在LAMP应用于布鲁氏菌病的诊断中也进行了大量的探索。潘文[9]等 (2010) 根据布鲁氏菌种特异的omp25基因建立了应用于布鲁氏菌病检测的新型可视化环介导等温扩增技术, 并用所建立的方法对布鲁氏菌S19株、S2株和M5株3株弱毒疫苗进行检测, 均显示阳性扩增结果。而对大肠杆菌、沙门氏菌、八叠球菌、金黄色葡萄球菌、巴氏杆菌、军团菌、枯草杆菌、溶血性链球菌扩增结果均为阴性, 扩增产物电泳图谱及Alu1酶切分析验证了LAMP产物的特异性。该检测方法的敏感性可达到10pg, 该方法还可以用于布鲁氏菌污染的牛奶样品的检测, 其敏感性达到5.2×103CFU。可视化LAMP方法用于布鲁氏菌病的检测无需特定的仪器设备和相关专业人员, 该方法的灵敏性和特异性均比较高, 阳性结果会直接产生颜色变化, 因此, 检测结果无需开盖分析即可用肉眼观察获得, 一步即可完成LAMP扩增及结果的判定, 降低了布鲁氏菌造成的生物安全威胁, 适合在基层广泛推广应用。
2.4 荧光PCR检测方法
Debeaumont[10]等 (2005) 建立了用于检测人血清样本中布鲁氏菌的Real-time PCR方法, 特异性和敏感性均优于细菌分离和血清学方法。Hinic[11]等 (2009) 基于IS711基因建立了Real-time PCR方法用于检测野猪血液样本中的布鲁氏菌, 并与细菌分离和血清学方法进行比较, 结果显示IS711 real-time PCR方法从血清阴性的样本中检出11.1% (16/144) 的阳性。孟茹[12]等 (2010) 利用二重Real-time PCR技术建立了鉴别诊断布鲁氏菌和结核杆菌的方法, 对24份结核痰样、11份布鲁氏菌基因粗提物及30份模拟奶样进行检测, 符合率为100%。
3 荧光偏振分析技术 (FPA)
荧光偏振分析技术是一种简单的用于检测抗原抗体相互作用的检测技术, 是国际贸易中指定的检测方法之一。FPA是一种同源性分析, 分析物不需要进行分离, 因而简便快捷。此检测方法的依据是溶液中分子的随机旋转, 分子大小是影响旋转速率的关键因素。用荧光素作为分子标记, 经过68.5°角度的转动时间可通过在垂直和水平方向的偏振光强度确定。大分子在单位面积的反射光强度比小分子的反光强度高。大多数的荧光偏振分析是将荧光素标记的分子量小于50k D的小分子抗原加入到待检血清或其他的液体中检测抗体, 如果存在特异性抗体, 则会结合到标记抗原上使分子的随机旋转速率下降, 下降的程度可以用荧光偏振分析仪检测出来。布鲁氏菌病的FPA诊断抗原是用FITC标记的平均分子量为22k D的S1119-3S-LPS。将抗原加入到血清或全血中检测抗体的含量, 反应结束后用荧光偏振检测仪检测结果。血清中抗体的检测大约需要2min, 全血或其他组织液仅需要45s。此方法用于布鲁氏菌病的检测迅速, 可以在实验室和田间条件下进行。Nielsen等 (2008) 建立了荧光偏振分析法用于牛布鲁氏菌的检测, 该方法选择的抗原是用FITC标记的牛种布鲁氏菌LPS-O链 (分子量在20~30k D) , 对9840份牛血清用FPA进行盲测, 同时设强阳性、弱阳性、阴性和A19疫苗免疫的牛血清作为对照, 所有的实验选用同一份标记抗原。最终检测结果表明FPA的敏感性为98.1%, 特异性为99.8%, 经ROC曲线分析, cutoff值由107.2m P降到90m P时敏感性升高到99.02%, 特异性为99.96%。Paulo[13]等 (2000) 用两组猪血清对i ELISA、c ELISA和FPA进行了评价, 一组血清来自加拿大的未感染布病的猪群, 另一组为缓冲抗原平板凝集试验 (BPAT) 和2-巯基乙醇试验 (2-ME) 检测为阳性的血清, 三种检测方法的特异性分别为99.9%、99.5%、98.3%, 相对BPAT和2-ME的敏感性分别为98.9%、96.6%、93.8%。用细菌分离为阳性的37份血清对以上检测方法进行评价, 相对敏感性分别为BPAT 86.5%;2-ME 81.1%;i ELISA 86.5%;c ELISA 78.5%;FPA 80.0%。Nielsen[14]等 (2002) 建立了用于牛乳中布鲁氏菌抗体检测的FPA, 敏感性和特异性均达到80%以上, 且可以区分S19疫苗免疫产生的抗体。Gall[15]等 (2000) 对应用于野牛布鲁氏菌病检测的几种方法进行了比较, 结果表明FPA和C-ELISA、I-ELISA的敏感性和特异性相当, 而BPAT效果较差, 同样也证明FPA可以区分S19免疫产生的抗体。FPA不仅可以应用于光滑性布鲁氏菌病的诊断, 同样也可用于绵羊附睾种布鲁氏菌、犬种布鲁氏菌、牛种布鲁氏菌RB51等粗糙型布鲁氏菌引起的疾病。Nielsen[16]等 (2004) 用FITC标记的绵羊附睾种、犬种和牛种RB51的RLPS作为诊断抗原, 试验证明只有RB51的R-LPS作为标记抗原是可行的。RLPS-FPA检测牛血清的敏感性和特异性分别为93.5%和99.8%, 检测羊血清的敏感性和特异性分别为78.1%和99.0%。此方法不能用于犬布病的检测。FPA用于布鲁氏菌病的检测敏感性和特异性良好, 与ELISA相比省去了洗涤和孵育的时间, 简便快速, 样品的用量少, 成本低, 且可以区分S19免疫产生的抗体和野毒的抗体, 用于布病监控对于有效控制布鲁氏菌病有重要意义, 是临床检测布鲁氏菌抗体的良好选择。
微生物学诊断 篇6
1.1 腺苷脱氨酶 (adenosine deaminase, ADA)
腺苷脱氨酶是嘌呤核苷代谢中重要的酶类, 属于巯基酶, 是一种与机体细胞免疫活性有重要关系的核酸代谢酶, 目前已广泛应用于结核性胸腔积液的鉴别诊断, 由于其临临界值尚不确定从而影响了阳性结果的判断。有研究显示ADA临界值>40 U/L在诊断结核性胸膜炎的敏感性为89.7%, 特异性为28.8%。有研究发现, 非结核性渗出性胸腔积液的ADA水平也常超过了40 U/L。有报道显示胸水中ADA为95 U/L作为临界值在其特异性、敏感性分别为69.2%、69.2%。因此, 有人提出的胸腔积液ADA的最佳临界水平为95 U/L;同时提出必须考虑患者的年龄因素。年龄<35岁、ADA<40 U/L的患者是结核性渗出性胸腔积液的可能性较小。有些研究提示隐匿的结核性胸膜炎可能被诊断为非特异性胸膜炎的患者ADA水平常<50 U/L。
1.2 结核抗体检测 (ATA)
胸腔积液的ATA检测方法操作简便, 反应快速, 不需要特殊仪器, 成本低廉, 易推广。有文献报道我国胸水中ATA敏感性和特异性分别为62%和93.1%[1]。还有研究提示血结核抗体阴性而胸腔积液结核抗体阳性, 有助于单纯性结核性胸膜炎的诊断;单纯性结核性胸膜炎组胸腔积液结核抗体主要来自于胸腔局部免疫反应。ATA虽然是一项传统的检测方法, 但其临床诊断作用仍不可小视。
2 细胞学免疫检测
2.1 趋化因子CXCL12
趋化因子CXCL12的来源主要是胸膜间皮, 肺部血管的内皮细胞, 支气管的上皮细胞, 巨核上皮样细胞, 和巨噬细胞, 它们对于CXCL12的着色是肯定的。CXCL12隐含在一些胸水的疾病中, 特别是在那些T细胞间接免疫的疾病中扮演着决定性的因素。有研究显示CXCL12在结核性胸膜炎中、非结核性胸膜炎和健康个体血浆中无显著差异, 但胸腔积液中结核组[ (4456±1013) pg/m L, n=15]显著高于非结核组[ (2851±1229) pg/m L, n=45] (P<0.01) 。对于结核性胸膜炎的诊断, 其敏感性和特异性分别是60.0%和93.2% (临界值是4600 pg/m L) 。目前仍处在研究阶段, 还未在临床中使用。胸腔积液中CXCL12的检测有望成为诊断结核性胸膜炎的重要参考指标。
2.2 脂阿拉伯甘露糖 (L ipoarabinomannan, Lam)
脂阿拉伯甘露糖是分枝杆菌属所特有的菌壁成分, 具有菌属特异性, 能够大量分泌且具有较高的免疫性, 当人体感染结核杆菌后, 免疫系统便会对此种抗原产生特异性抗体Ig G, 及抗脂阿拉伯甘露糖的抗体 (LAM-Ig G) 。因此, 临床上检测其含量, 特别是联合检测结核分枝杆菌DNA和LAM-Ig G, 对于诊断结核性胸腹腔积液有一定的临床应用价值。
3 分子生物学检测
核酸扩增试验 (nucleic acid amplification tests, NAATs) 病原体的分子生物学检测 (DNA与m RNA) 传统的细菌学检查在结核性胸膜炎的诊断上缺乏敏感性和时间消耗较长。核酸扩大试验使用核酸探针扩大了结核分枝杆菌的特有的核酸序列, 在临床胸水样本中能够直接检测结核分枝杆菌。有研究显示胸水核酸扩大试验特异性91%, 敏感性76.5%。几乎相似的结果也在另一项系统观察和40个研究者的Meta分析中得出。理论上, NAATs敏感性及特异性都较高, 但是, 临床上结果并非如此, 胸水中的各种限制因素和分枝杆菌细胞内扣押等原因可能是造成其敏感性低及假阴性的原因。NAATs在不同临床研究中的结果的不一致和昂贵的费用限制其临床应用。在临床中, NAATs阳性并不是结核性胸膜炎的确诊条件, 只是诊断中的一项参考指标。
4 肿瘤标志物
糖类抗原Ca125, 它可存在于各种胚胎体腔上皮来源的组织中, 在正常人血清中CA125含量甚微。有文献报道, Ca125在结核血清中有升高改变。其产生机制目前尚不明确。有待进一步研究。目前特异性不高, 未列为诊断结核性胸膜炎的依据之一, 需结合其他实验室检查的结果综合判断, 在与恶性胸水的鉴别诊断中有一定的临床意义。
目前趋化因子CXCL12和ELISA Ig A MT10.3-MPT64仍在研究中, 其敏感性和特异性有待在临床中进一步观察。IGRAs实验结果是对结核感染的判断, 阳性结果包括了活动性结核与潜伏结核感染的可能, 需要结合临床来确诊是否是结核病患者。有学者提出荧光ELISPOT技术, 能在单细胞水平同时检测两种甚至多种细胞因子, 且不会造成斑点混色无法识别, 在保证高敏感度同时大大提升了ELISPOT技术的应用价值, 有望更准确诊断结核感染状态。希望未来可以通过对胸水标本的检测可以直接得到活动性结核的判断结果, 且特异性和敏感性都在95%以上。新型蛋白质及Micro RNA也为我们在分子生物学方向的研究指出了新的目标。总之, 未来加深对胸水中相关的高特异性、敏感性的诊断指标的研究是尤为重要。
摘要：结核性胸膜炎 (tuberculous pleurisy, TP) 是肺外结核最常见的一种, 也是我国渗出性胸膜胸腔积液中最常见的病因。目前, 由于缺乏有效的诊断指标, 结核性胸膜炎的诊断仍然是一个挑战。因此, 开展结核性胸膜炎相关的高特异性、敏感性的诊断指标的研究显得尤为重要。本文对结核性胸膜炎胸水的多种生物学指标的研究及诊断方法作一综述。
关键词：结核性胸膜炎,生物指标,诊断
参考文献
微生物学诊断 篇7
1 资料与方法
1.1 一般资料
以我院于2014年1月至2016年1月收治的94例肺炎支原体感染患儿为研究对象, 按照随机数字表法将患儿分为研究组和对照组, 各47例。研究组中, 男性25例, 女性22例, 年龄2~9岁, 平均年龄 (5.8±1.1) 岁;患病时间1~7 d, 平均患病时间 (3.3±0.6) d。对照组中, 男性28例, 女性21例, 年龄2~11岁, 平均年龄 (5.6±1.2) 岁;患病时间1~8 d, 平均患病时间 (3.1±0.7) d, 两组基础资料比较无显著性差异 (P>0.05) 。
1.2 诊断方法
采用微生物快速培养检测方式对对照组患儿病情进行诊断, 具体措施为:采用无菌棉拭对患儿咽喉及口腔标本进行采集, 然后将标本放入收集器的培养皿之后置于固定培养基中, 最后将标本置于恒温培养箱, 恒温箱温度控制在37℃左右, 时间控制在24 h, 对培养箱中的标本实施监测, 特别是标本颜色。阳性结果判定具体标准为:培养箱中标本由原来的红色逐步变为黄色。阴性结果判定标准为:经过24 h的培养箱培养, 标本的颜色仍然没有任何变化。
研究组行快速血清学检验, 于患儿入院后第二天清晨, 空腹抽取2 m L静脉血, 离心分离, 取血清, 采用吸附免疫法对特异支原体球蛋白水平进行检测, 对于一些检测结果为阴性的患儿, 需要在一个星期左右再次进行复查。阳性结果判定标准为:MP-IGM水平不足160:1[2]。
1.3 观察指标
支原体感染肺炎疾病治疗前诊断结果与治疗后证实结果符合率、肺炎诊断的误诊和漏诊情况。
1.4 统计学方法
用SPSS18.0统计学软件处理数据, 计数资料用n/%表示, 用χ2检验, 以P<0.05为有统计学意义。
2 结果
2.1 两组患儿肺炎诊断符合率比较
对照组患儿支原体感染肺炎疾病治疗前诊断结果与治疗后证实结果的符合率为76.6%;研究组患儿支原体感染肺炎疾病治疗前诊断结果与治疗后证实结果的符合率为95.7%, 研究组符合率显著高于对照组 (P<0.05, 表1) 。
2.2 两组患儿肺炎诊断的误诊和漏诊例数
研究组患儿肺炎诊断的误诊数和漏诊数分别为0例 (0.0%) 、2例 (4.3%) , 明显低于对照组的4例 (8.5%) 和7例 (14.9%) , 差异有统计学意义 (P<0.05) 。
3 讨论
肺炎支原体感染疾病是指以肺炎支原体为病原体的肺部疾病, 属于小儿肺炎疾病中最为常见的一种, 对患儿的身体健康和生长发育都会产生严重影响。由于小儿肺炎支原体感染疾病的临床症状表现通常缺乏特异性, 使诊断受到一定影响。近年来随着我国医学领域相关研究的进一步深入, 生物学技术水平的更新发展, 对肺炎病症的支原体感染进行检测已经成为可能。现今对肺炎支原体进行检测的方式较多, 主要包含分离培养检测、血清检验、微生物监测、即试冷凝检测等, 但效果不一, 其中快速血清学检验应用效果显著, 临床价值较高, 可推广应用[3]。
本研究选取治疗后小儿肺炎支原体感染94例患儿进行分组对照观察 (对照组47例行微生物快速培养检测, 研究组47例行快速血清学检验) , 结果显示, 研究组诊断符合率显著高于对照组;研究组研究对象肺炎诊断的误诊和漏诊率明显低于对照组。可见, 采用快速血清学检验方式诊断小儿肺炎支原体感染, 效果显著, 诊断符合率高, 误诊、漏诊率低。
参考文献
[1]王国军.小儿肺炎支原体感染临床检验的诊断价值[J].现代医药卫生, 2015, 31 (2) :254-255.
[2]王艳敏.小儿肺炎支原体感染行快速血清学检验与微生物培养检测的价值比较[J].中国现代药物应用, 2015, 9 (19) :29-30.